随着基因编辑技术的飞速发展，表观基因组编辑作为一种无需改变DNA序列即可调控基因表达的手段，受到了生物医学领域的广泛关注。近年来，基于CRISPR-Cas系统的编辑工具，尤其是体积较大的Cas9蛋白，已经成为基因组编辑的主流选择，但由于其较大的蛋白尺寸，导致在体内递送时常常面临载体容量限制等挑战。针对这一难题，一项以进化为指导的蛋白设计策略，成功优化了IscB蛋白及其引导RNA（ωRNA），创造出名为NovaIscB的高度活性、特异且紧凑的编辑工具，为持久体内的表观基因组编辑带来了全新可能。IscB蛋白是OMEGA（Obligate Mobile Element Guided Activity）系统中的关键组成部分，属于一种小型的RNA引导核酸内切酶，其被认为是Cas9的祖先，天然大小约为300到550个氨基酸，远小于SpCas9等传统编辑因子。IscB具有多重独特优势，不仅体积小，有利于利用AAV等现有载体实现高效递送，而且其双核酸酶构造能够精准调控DNA链条的切割方式，加之结构复杂的ωRNA作为引导分子，提供了广阔的工程改造潜力。通常，IscB在编辑活性和特异性之间存在权衡，其引导序列短（约13个核苷酸），带来较低的基因组识别特异度，限制了其作为精准编辑工具的应用。
为提升这一系统的整体性能，研究团队通过大量同源物筛选，结合AlphaFold2结构预测和理性设计，实现了IscB蛋白REC结构域的插入和循环优化，大幅提高了IscB与目标DNA引导序列的结合稳定性和特异性识别能力。他们发现，通过将来源于近亲Cas9蛋白的REC结构域“移植”至OrufIscB蛋白中，可以接触并稳定引导RNA与靶标DNA更长的互补序列区域，从而将有效引导长度从13核苷酸提升至15至16核苷酸，同时提升编辑效率最高达100倍以上。此外，对REC结构域中的灵活区段进行序列调换，进一步增强了蛋白与核酸复合物的相互作用，使得新设计的NovaIscB不仅活性出众，还能稳定识别更长的引导序列，有效降低脱靶效应。在调控RNA组分方面，研究团队对ωRNA进行结构导向的简化设计，成功去除了多余、不必要的序列片段，同时保留了必需的功能区域，使得ωRNA长度大大缩减，同时表达稳定性得到提升。这样不仅减小了整体编辑复合物的尺寸，也方便了合成和递送，有利于在细胞和体内环境中维持良好的编辑活性。更具创新的是，团队还设计了基于ωRNA的条件激活开关机制，能够通过外源补充特定RNA序列实现编辑活性的可控开关，为未来安全性和时空调控的基因编辑提供新思路。
基于NovaIscB，研究者还进行了多种功能域的融合尝试，例如将核酸酶失活的NovaIscB与DNA甲基转移酶3A（Dnmt3A）、其伴侣Dnmt3L及锌指KRAB结构域结合，开发出OMEGAoff系统，实现对靶基因的表观遗传修饰和稳定转录抑制。值得一提的是，NovaIscB的紧凑体积使上述复合体及导RNA仍能被装入单一的AAV载体中，极大简化了临床递送载体的设计和制造。实验中，OMEGAoff不仅在体外细胞系展现出对特定基因如MYL6、ASCL1、PCSK9的高效抑制，还通过AAV载体在小鼠肝脏中实现了持久的PCSK9基因沉默，降低血清PCSK9蛋白及全胆固醇水平，显示出卓越的体内功能持久性和安全性。整体而言，通过结合大规模同源物筛选、AlphaFold2结构预测、蛋白域工程、RNA结构简化与融合蛋白设计，这项研究成功构建了新一代的紧凑高效核酸编辑工具NovaIscB，为基因组学和表观基因组学的应用开辟了广阔前景。与传统SpCas9相比，NovaIscB具有更小的尺寸，更易于体内递送，活性强且特异性好，尤其适合携带复杂功能结构域的融合蛋白体系应用。在未来，扩展NovaIscB对目标序列附近的TAM（靶标邻近基序）的容忍度，优化对非典型TAM的识别，提升编辑效率，将进一步增强其应用灵活性。
结合化学修饰的ωRNA递送、新型融合蛋白构建以及多样化AAV血清型组合，NovaIscB有望成为临床基因治疗，尤其是疾病相关表观基因调控的重要工具。该研究不仅展示了进化驱动的自然序列多样性与现代结构预测工具结合，在蛋白工程领域的强大潜力，还为众多其他蛋白功能优化和设计树立了典范。未来，通过进一步优化结合精准靶向以及安全性评价，NovaIscB及相关OMEGA系统将助力基因治疗领域实现更加安全、持久和高效的遗传信息调控。总结而言，NovaIscB的诞生标志着基于进化设计的紧凑型编辑蛋白临床开发迈出坚实一步，其持续稳定的表观基因组编辑能力为治疗复杂遗传性及表观遗传性疾病开辟了新路径，奠定了精准医学未来发展的坚实基础。
