随着基因编辑技术的不断进步,碱基编辑器作为一种无需打断双链DNA且可精确修正单个核苷酸突变的工具,展现出深远的临床应用潜力。单碱基突变是众多遗传疾病的根本原因,改变错误的核苷酸序列,有望彻底根治这些疾病。然而,当前多数碱基编辑器存在宽泛的编辑窗口,导致除目标位点外的邻近碱基也发生意外改变,即旁观者编辑。这不仅降低了编辑的精确度,也增加了潜在的安全风险,特别是在治疗应用中更是不可忽视的难题。针对这一瓶颈,研究者们提出了一种结构引导的蛋白质工程策略,通过嵌入天然的寡核苷酸结合模块,增强碱基编辑器与非目标DNA链的特异性结合,有效收窄编辑窗口,从而减少副作用。具体而言,该策略聚焦于对腺嘌呤脱氨酶TadA-8e的工程改造。
TadA-8e是目前已知最具活性的脱氧腺苷脱氨酶,其结合活性窗口可覆盖约十个碱基,显著增大了旁观者编辑概率。通过借鉴人类RNA结合蛋白Pumilio1的结构特征,研究人员在TadA-8e的活性中心引入类似的寡核苷酸结合模块,形成额外的堆叠作用、氢键及电荷相互作用,从而稳定了DNA非目标链在酶活性位点的构象。这种分子级别的修饰不仅提升了编辑的定位精准性,也降低了非特异性脱氨酶活性。基于结构设计的TadA-NW1变体表现出了在多个细胞模型中,极窄的四核苷酸编辑窗口,相比原始的TadA-8e极大缩小了作用范围。通过与不同的Cas9变体融合,TadA-NW1依然保持了高效的A-to-G转换能力,同时显著减少了Cas9依赖和非依赖的离靶编辑事件。这种设计理念的应用还扩展至其它类型的碱基编辑,例如利用改造后的TadA-NW1实现环胞嘧啶和腺嘌呤的精确转换,展示了灵活的酶学适配能力。
此外,该工程策略解决了诸如CFTR W1282X等因单核苷酸突变引发的严重遗传病。在人类肺上皮细胞中,使用ABE-NW1成功实现了高效且准确的突变位点修复,旁观者编辑率明显降低,从而显著提升了蛋白质的正常表达和功能恢复,这无疑为治疗难治性疾病提供了切实可行的基因疗法新思路。在具体实现层面,研究团队利用高通量测序技术深入分析了TadA-NW1及其衍生碱基编辑器在多个基因组位点的编辑效率与特异性,确认了其优异的性能。值得一提的是,粗放的编辑窗口往往与脱氨酶对DNA的快速催化反应相关,增强与非目标链的结合稳定性反而能减缓催化速率,减少非特异性编辑,从机制上揭示了旁观者编辑降低的本质原理。除此之外,工程化后的编辑器展现了更为有限的Cas9相关及独立脱氨酶介导的DNA脱氨酶活性,减少了基因组非靶向突变风险。结合全基因组测序结果,ABE-NW1并未引入新的显著脱靶突变,体现了其安全性优势。
基于此,研究者认为整合天然核酸结合结构模块是未来碱基编辑器设计的重要方向,能够有效兼顾编辑效率和精准度。此外,随着人工智能驱动的蛋白质结构预测技术发展,像AlphaFold这样的工具将极大促进类似工程策略在多种碱基编辑酶及Cas蛋白上的推广和优化,拓宽编辑靶点范围和应用潜力。编辑窗口的限制,除了酶学改造,还能通过调整连接Cas9核酸酶与脱氨酶的柔性连接肽实现。去除或缩短该连接肽可进一步"聚焦"编辑活性,使得编辑器在特定基序位置实现单碱基改写,前提是在保证靶向效率不显著下降的情况下,更多兼备定向性与活力。谱系分析和对比结果还显示,尽管与选定的单碱基编辑器ABE9相比,ABE-NW1的编辑窗口稍宽,但适用范围更广,不受限于特定碱基位点,为临床基因校正提供更大的灵活性和可能性。对临床转化的考量驱使开发可兼容多种Cas9 PAM序列识别扩展变体的碱基编辑器,每当适配标准SpCas9以外的版本,例如NG-Cas9或VRQR-Cas9时,TadA-NW1表现出同样或更优的编辑特异性和效率,有效拓宽编辑范围满足不同基因位点的需求。
回归临床意义,CFTR的W1282X突变以其造成的蛋白截断及功能丧失,严重威胁患者生命质量。传统编辑器因旁观者位点频繁误编辑,往往导致新的有害变异,降低了治疗效果,甚至带来负面影响。ABE-NW1结合合适的sgRNA设计成功实现高比例的精准修正,且旁观者副作用最小,显著提高正常CFTR蛋白的表达,呈现出极佳的治疗潜力。该案例充分展示了精细调控碱基编辑窗口对遗传疾病基因疗法质量的关键影响。实验室基于化学修饰mRNA和sgRNA的优化传送方式,也提升了编辑效率和细胞耐受性,再次加固了实际应用的可行性和安全性保障。尽管如此,碱基编辑技术仍面临造型结构的限制,部分碱基编辑器或Cas9蛋白缺乏高分辨率结合结构,或由于蛋白体积过大限制在特定细胞中的递送效率,未来结合人工智能辅助预测及微小Cas蛋白改造将是突破口。
总的来看,通过引入天然核酸结合模块,提升编辑器对非目标链的结合稳定性和特异性,成功开发出具有高活性与高精确性的碱基编辑器,使非特异性旁观者编辑显著降低,提升治疗安全性和效果。这样简洁有效的结构导向重构策略,开启了基因编辑向更精密、安全层面迈进的新篇章,具有广阔的科研与临床推广前景。未来深入研究其在更多细胞类型及体内环境中的表现,联合免疫原性、递送和脱靶检测技术,将推动碱基编辑器向广泛基因治疗的临床转化。 。
