蛋白质合成是所有生命细胞内极为重要的生物过程，它将遗传信息从核酸转录成多肽链，随后折叠成功能蛋白。翻译过程由核糖体主导，在细菌中，对识别翻译起始点具有关键作用的是上游的Shine-Dalgarno序列，确保了翻译的准确启动。随着蛋白链的延长，肽链在核糖体的出口通道内逐渐扩展，直至遇到终止密码子，实现肽链释放，从而完成翻译终止。然而，近年研究发现，新生肽链本身并非被动产物，反而通过与核糖体出口通道的特殊相互作用，能够促使翻译暂时停滞甚至调控后续基因表达，展现出复杂且多样的翻译调节机制。最新发表在《自然通讯》上的研究揭示了一种独特的迷你发卡形态的新生肽PepNL，能够以不同于传统机制的方式，阻断翻译终止，开启了对翻译过程调控的新理解。该研究由东京大学等机构的研究团队完成，通过系统筛选未被充分认识的小开放阅读框编码的新生肽，结合表型、蛋白质组学和质谱技术，成功发现了具有翻译终止阻断功能的PepNL和NanCL两种肽。
其中PepNL通过其14个氨基酸残基形成的紧凑迷你发卡结构，实现对核糖体释放因子RF2功能的抑制，显著阻碍肽链释放过程。以往研究表明翻译终止依赖于释放因子RF2在核糖体肽酰转移中心（PTC）插入含有GGQ序列的活性位点，水解肽链与tRNA之间的酯键，完成肽链释放。新的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构分析显示，PepNL新生肽的N端分子竟然回折朝向核糖体出口通道入口，形成一种与传统肽链延伸方向相反的迷你发卡形态。这种构型通过芳香族和疏水相互作用稳定，区域内关键残基如异亮氨酸和酪氨酸彼此形成β折叠样主链氢键，同时与23S rRNA的特定位点紧密结合，增强其稳定性。更重要的是，新生肽的这一发卡结构改变了周围肽链和rRNA的几何环境，导致释放因子RF2的GGQ活性位点无法正确插入PTC，从而抑制其水解活性，使肽链无法从tRNA上释放，翻译终止功能被阻断。结构对比分析指出，PepNL的异亮氨酸残基在阻断翻译终止中扮演了关键角色，其空间位阻与RF2的关键谷氨酰残基发生冲突，进一步引发RF2构象异常，穩定了其非活性状态。
这种阻断机制与此前已知的调节性新生肽如TnaC、SpeFL不同，不依赖外源性代谢物或小分子诱导剂，而是完全由其氨基酸序列自发驱动，体现出独特的自控性质。此外，PepNL的翻译中止可被内源性Trp-tRNATrp介导的终止密码子UGA的读穿所抑制。在缺乏色氨酸时，肽链以发卡结构阻断终止，发生翻译停滞；而在色氨酸充分时，Trp-tRNATrp读取UGA并继续肽链延伸，阻断得以解除，形成精细的动态调控体系。实验还表明这一读穿效应在停止密码子替换实验中表现出高度特异性，仅UGA展现显著读穿活性，提示其在环境营养状态对翻译终止调控中的潜在感应功能。该机制为解决此前翻译终止调节的复杂性提供了新思路。大多数已知的RAP（ribosome arrest peptides）须依赖代谢物作诱导，然而PepNL利用其结构和读穿调节形成了一种基于翻译时间窗口的调节模式。
研究推测PepNL发卡结构的折叠过程存在一定延迟，使得读穿tRNA有机会介入、阻止结构形成，确保翻译顺利完成。而一旦发卡成型，则阻止终止因子及读穿tRNA正常功能，延长停滞状态。此机制类似于SpeFL肽通过非最优稀有密码子调控折叠折返进程的原理，展示了不同新生肽在翻译调控中对结构折叠动力学的巧妙利用。PepNL的翻译还关联调节其下游基因pepN的表达，pepN编码一种广谱氨基肽酶，在氨基酸代谢及环境适应中发挥作用。尽管RNA二级结构分析显示，pepNL的停止子和下游啟動子区域具有潜在干扰结构，但PepNL的翻译阻断并未显著影响其下游基因的RBS可及性，暗示其调控机制可能更加复杂，涉及转录后步骤或核糖体复合物动态。除此之外，本研究以E. coli为模型，从全景视角梳理了中短小ORF的翻译行为及对蛋白质表达的影响，证实了多达18种新型RAP肽的存在，其中PepNL表现出最强的细胞生长抑制效应和翻译阻断活性，这不仅拓宽了RAP家族的成员范围，也为合理设计与合成基因调控元件提供了丰富素材。
通过textms和蛋白质组学相结合的创新方法，成功验证了新生肽肽基tRNA的积累，证实翻译停滞点位于终止密码子，符合预期的阻断模式。该策略可广泛应用于发掘更多细菌及真核生物中的翻译调控肽，促进翻译生物学领域的深入发展。综合来看，迷你发卡PepNL肽表现出以自身独特的空间构象扰乱释放因子活性、阻断终止反应、并利用终止密码子读穿状态动态调节翻译进程的创新机制，标志着自然界中蛋白质合成调节的又一独特策略。其揭示了蛋白合成过程中氨基酸序列编码以外，三维结构折叠和翻译动力学时间窗口的重要影响。未来，进一步探索类似RAP的多样性、小肽结构与翻译调控功能的关系，将为分子生物学、基因表达调控及合成生物学领域带来深远的启示。同时，基于PepNL机制设计的人工调控元件，有望实现对氨基酸环境敏感的精细基因表达控制，为生物医药、代谢工程优化提供潜力。
总体而言，迷你发卡肽阻断翻译终止这一新颖发现，深化了对翻译后期调控机制的理解，彰显出生物分子构象与功能耦合的非凡智慧，是蛋白质生物合成领域的重要里程碑。
