基因编辑技术已成为现代生命科学的核心工具,推动了医学、农业和基础生物学的诸多进步。在众多基因编辑手段中,Prime编辑技术因其无需依赖双链断裂和外源DNA模板,能够直接写入精准序列而备受青睐。然而,尽管Prime编辑器在精准度和适应性方面展现出巨大潜力,其仍面临着生成插入缺失(indel)错误的问题,限制了技术的广泛应用与临床转化。近日,科研团队通过蛋白工程策略,成功研发出一种新型的工程化Prime编辑器,显著降低了基因组编辑过程中的基因错误,开创了基因组精准修饰的新局面。 Prime编辑的核心机制是结合Cas9 nick酶与逆转录酶,以及特殊设计的扩展向导RNA(pegRNA),以完成对目标基因组DNA的程序化改写。典型过程始于Cas9 nickase在目标DNA的特定位点产生单链切口,3'末端DNA链则与pegRNA上编码的模板序列配对,逆转录酶利用该模板合成经过编辑的DNA扩展链。
然而,在该过程中,新合成的3'端DNA链需要替换目标位点原有的5'链,而这一替换过程受到天然分子构象和DNA链相互作用的阻碍。具体表现为被竞争的5'链更易被保留,导致编辑效率降低,同时诱发插入缺失等错误,影响编辑结果的纯度和预期效果。 针对这一限制,科学家从Cas9蛋白的结构与功能角度出发,试图通过调节Cas9与DNA的结合方式释放5'链的稳定性,从而促进该链的选择性降解。通过系统筛选Cas9中的关键氨基酸位点突变,团队发现一些特定突变能够放松Cas9对nick位置的精确控制,引发非目标链5'端的失稳和降解。更为关键的是,这种降解过程减少了5'链锁定延续,降低了其对新编辑链的竞争性,从根本上改善了编辑链的结合效率与稳定性。 在此基础上,科学家构建了多种含有放松nick定位突变的Prime编辑器,发现这些改造型Prime编辑器不但有效地降低了插入缺失错误的发生率,且基本保持了编辑效率。
其中,一种名为精确Prime编辑器(pPE)的双突变体特别突出,能将indel频率降低数十倍,编辑与错误产生比率显著提升,实现极高的编辑纯度。尽管pPE实现了错误率的大幅度降低,编辑效率却存在轻微下降,这一问提出了进一步优化的需求。 开展后续改造时,研究团队通过借鉴已知提高Cas9活性的突变,结合pPE设计出高效变体xPE,不仅恢复甚至略微提升了编辑效率,还维持了极低的基因组错误率。xPE的优势在于其能够在多靶点、多类型编辑任务中稳定发挥,表现出普适的优异性能。 进一步考量pegRNA分子的稳定性对编辑效率的影响后,团队整合了RNA保护策略,将La RNA结合蛋白模块融合至xPE结构中,诞生了超精确Prime编辑器(vPE)。vPE可有效保护pegRNA结构,缓解因nick位置重新定位引起的pegRNA结合效率降低问题,继而显著提高整体编辑效率。
多次实验验证表明,vPE在保持极低基因组误差率的同时,将编辑效率提升至与目前主流Prime编辑器PE7相当甚至更佳的水准,堪称性能与精准的平衡之作。 实验数据全面覆盖多种编辑类型,包括点突变、插入和删除,均展现出vPE广泛应用的适用性。研究人员在HEK293T、A549和HeLa等多种细胞系内均确认了vPE的高效性和低误差率,进一步拓展到小鼠胚胎干细胞的功能性编辑中,也实现了高编辑效率与低插入缺失事件的理想结合。 不仅于靶向基因组,vPE还表现出对已知脱靶位点的显著抑制编辑活性,相较PE7,off-target编辑频率降低了多达14倍。这一性能使得vPE在临床前疗法开发中具备极佳的安全性潜力,减少潜在的不良基因突变风险。对编辑结果的深度测序显示,vPE引入的误差主要降至测序噪声背景水平,极大地提升了编辑结果的确定性和一致性。
此项研究不仅为基因编辑提供了新一代工具,也提出了全新的设计理念:通过破坏DNA末端稳定性促进错误链的降解,从而提升编辑链的结合优势,并借助RNA结构保护策略弥补可能带来的效率损失,实现精准与高效的双重目标。此设计范式有望扩展至其他依赖多功能蛋白复合物的基因组编辑平台,包括基于DNA聚合酶的编辑系统及其它新兴技术。 在实际应用层面,精确且低误差的Prime编辑器极大减少了基因改造时的不可预测风险,利于复杂、多重编辑任务的开展,如基因治疗、基因驱动、细胞工程以及分子生物学研究。其无需外源调控因子或扰动宿主细胞的设计优势,使得该技术更易于与现有的基因编辑方案整合,提高了推广和临床转化的可行性。 面对多样复杂的基因组环境,该工程化Prime编辑器仍需结合合理的pegRNA优化,以克服因不同靶点序列结构导致的可变编辑效率。未来努力方向应致力于设计智能化、高通量筛选的pegRNA设计工具,辅以结构优化的Prime编辑器,以实现真正个性化、精准的基因组修饰。
总的来说,工程化Prime编辑器的问世标志着基因编辑迈向更高精准度的里程碑。它以创新的蛋白质工程手段结合分子机制洞察,成功解决了长期阻碍精确编辑的难题。伴随着后续在多领域的推广应用和优化完善,未来有望引领基因疗法及合成生物学进入一个安全、可控、高效的新阶段,为人类健康和生物科学探索注入强劲动力。 。
