噬菌体作为地球上数量最多的生命实体,具有极其丰富的遗传多样性和复杂的生物学功能,成为分子生物学和微生物学领域的重点研究对象。然而,由于许多噬菌体及其宿主细菌的遗传操作受限,传统的遗传学方法难以全面揭示噬菌体基因的作用和功能。近期发展起来的可编程反义寡核苷酸(antisense oligomers,ASOs)技术,通过设计合成短链核酸分子选择性结合目标mRNA,阻断其翻译,提供了一种非遗传学的基因沉默手段,为噬菌体功能基因组学研究带来了革命性的突破。ASOs的介入突破了基因编辑技术在噬菌体研究中的障碍,尤其对基因组庞大且结构复杂的巨型噬菌体如ΦKZ表现出显著的应用潜力。ΦKZ噬菌体拥有280kb的双链DNA基因组,其感染过程复杂,涉及先形成"早期感染囊泡"(early phage infection vesicle),随后组装以核蛋白为基础的"噬菌体核",该结构巧妙保护噬菌体基因组免受宿主防御系统如CRISPR-Cas的攻击。传统一些针对DNA靶向的基因操作方法因噬菌体核的保护作用而受限,而ASO技术作为一种靶向mRNA的策略,能够有效进入细胞质并结合病毒转录的mRNA,从而在蛋白质合成之初阻断关键噬菌体基因表达。
该方法不仅能实现对噬菌体核心基因如编码核壳蛋白ChmA的有效抑制,还能解析诸多功能不明的辅助基因的生物学作用。实验中针对ChmA的ASO处理成功阻断噬菌体核的形成,导致噬菌体复制周期中断,显著降低病毒子代数量,验证了该基因在感染过程中的必需性。除核心基因外,针对核蛋白进出口蛋白PicA、非病毒RNA聚合酶组件及PhuZ细胞骨架蛋白的ASOs同样表现出了独特且精确的抑制效果,前者参与转运新合成酶入核,后者帮助定位噬菌体核于宿主细胞中央,均通过ASO敲低表现出相应的表型变化。值得关注的是,ASOs的高度可编程性允许有效覆盖多种靶点区域,通过设计覆盖mRNA的核糖体结合部位或者启动子序列,配合优化的载体肽(CPP)传递体系,实现高效、特异的靶标抑制,且降低脱靶效应。系统性功能筛选揭示,约三分之一的ΦKZ核心及辅助基因对于病毒复制具有显著影响,表明实体基因库中尚有大量潜在关键因子亟待研究。结合RNA测序技术,ASO介导的基因沉默亦揭示了复杂的转录组变化,反映不同基因抑制引发的噬菌体及宿主细胞转录动态,助力构建全面的感染过程分子图谱。
例如,沉默ChmA不仅阻断噬菌体核的形成,还影响中后期基因的表达。此外,某些ASO诱导的转录变化还揭示宿主反应的细微调控机制,如特定压力响应与免疫调节因子的激活,展示宿主与噬菌体的复杂共演状态。除了在典型模型菌株中的成功应用,ASO技术还在临床分离株和多种不同菌种中展示了适用性,突破了基因编辑困难的技术瓶颈。针对临床多重耐药菌株的噬菌体研究,ASO可以帮助评估关键基因的功能,以及设计更有效的噬菌体疗法。特别是在噬菌体治疗领域,ASOs不仅可作为功能研究工具,还能优化噬菌体组装和增殖过程,提高治疗效果及特异性。其非遗传学性质也降低了对环境和宿主的潜在风险。
值得一提的是,ASO不仅适用于DNA噬菌体,也能靶向RNA噬菌体的关键基因,显著抑制其复制,拓展了该技术的应用范围。此外,近年来研究揭示ΦKZ155这类含RNase H结构域的噬菌体蛋白,作为噬菌体核成熟及基因组扩增的关键决策因子,在感染周期中扮演核心调控角色。通过ASO沉默该基因可诱发噬菌体进程停滞,显示其核内定位与功能密不可分。补偿性表达实验证实,ΦKZ155的催化活性并非基因必需性所在,提示其可能发挥结构或调控作用。该发现丰富了我们对噬菌体复制机制的理解,也为结构功能关系研究提供了新路径。虽然ASO技术展现出巨大潜力,但仍面临部分技术挑战。
高效的细胞内递送依赖于载体肽的选择和优化,不同细菌细胞壁结构差异影响其传递效率,载体肽的潜在毒性也需评估。ASO设计需规避托管mRNA降解带来的复杂性,合理选择靶点以确保翻译阻断效果。基因组注释不完善和存在复杂转录单元也给靶向设计带来困难。此外,ASO主要实现mRNA水平的敲低,难以靶向已存在的病毒蛋白,对靶标表达的时间窗亦有限制。展望未来,可编程反义寡核苷酸技术有望结合高通量筛选与多组学手段,实现噬菌体基因功能的系统解析。辅助技术如单细胞转录组测序、实时成像及结构预测有望协同揭示噬菌体感染的动态过程及分子互作。
ASO技术还可以拓展至环境微生物学、工业发酵和生物安全领域。例如,通过精准调控噬菌体生命周期,提高生物防控效率;或在发酵体系中精准调节细菌与噬菌体的平衡,保障生产过程稳定性。随着合成生物学的兴起,ASO也有潜力作为调控模块,在定制噬菌体载体和合成病毒设计中发挥关键作用。总结而言,可编程反义寡核苷酸提供了一条非基因组修饰路径,有效突破了噬菌体遗传难题,拓宽了研究视野。其在功能基因组学、高通量筛选和多样性噬菌体-宿主系统中的应用,必将推动基础病毒学、抗菌疗法开发及生物技术创新的融合发展,开启噬菌体研究的新纪元。 。
