在现代生物技术领域，基因编辑工具的开发不断推动科学研究与临床应用的进步。尤其是在精准调控基因表达和修饰遗传信息的需求日益增长的今天，体内表观基因组编辑技术受到了极大的关注。表观基因组编辑不仅改变DNA序列，更作用于基因表达调控机制，是治疗遗传疾病、癌症及复杂多基因疾病的重要手段。近期，科学家们通过对IscB蛋白进行进化引导的蛋白设计，成功实现了体内持久表观基因组编辑，开创了基因编辑领域的一个新纪元。 IscB蛋白作为一类紧凑型的RNA引导核酸酶，拥有大约300至550个氨基酸。它被认为是CRISPR-Cas9系统的祖先进化型，具有双核酸酶域的独特结构。
这种紧凑的蛋白结构使其极具应用价值，尤其是在限制性载体如腺相关病毒（AAV）中进行体内递送时展现出明显优势。传统的Cas9蛋白较大，往往需要多个载体进行包装，增加了递送难度和免疫反应风险。相比之下，IscB的体积小巧，为基因编辑工具的小型化提供了天然基础。 然而，原始的IscB蛋白在基因编辑活性和特异性方面存在着一些不足。首先，其引导RNA（ωRNA）导引的靶序列较短，约为13个碱基，这导致在复杂基因组中潜在的脱靶效应较多，限制了其在人体细胞中的精准应用。其次，相较于Cas9，IscB的发展尚处在初期阶段，对于其蛋白结构与功能的理解还不够深入，缺乏高效的蛋白质工程优化。
针对这些挑战，研究团队采取了多维度的工程策略，结合大规模自然同源物筛选、结构引导的蛋白域插入及RNA结构优化，依托深度学习辅助的结构预测技术，成功设计出一种性能显著提升的IscB变体——NovaIscB。NovaIscB不仅在基因敲除的插入缺失（indel）活性上实现了对野生型IscB的近百倍提升，还显著延长了有效引导长度至20个核苷酸，增强了识别目标序列的特异性。 这一工程设计的核心在于对IscB蛋白中一个关键的识别结构域——REC域进行插入和优化。REC域在Cas9家族中被证实为识别和稳定蛋白与引导RNA-目标DNA杂交体的重要模块，参与引导长度的调控及脱靶检测。通过借鉴相关Cas9和IscB同源异构体的REC结构，团队将其功能性REC域段插入OrufIscB蛋白中，并通过多种环插换组合进一步调节蛋白-核酸相互作用，实现兼具高活性和高特异性的平衡。这种基于自然进化多样性的巧妙“拼接”，让NovaIscB获得了优越的性能表现。
此外，团队还针对ωRNA进行了结构精简设计。原始的ωRNA较长，不利于在有限包装容量下的病毒载体输送。通过基于冷冻电镜（cryo-EM）解析的RNA三维结构，识别出非必要的5′引导接头和3′末端非结构化序列，成功截短ωRNA约59个核苷酸，不仅减小了整体系统大小，还显著提升了RNA的细胞稳定性和表达水平。 基于NovaIscB的稳定特异性和紧凑结构优势，研究团队将其融合以构建多种功能性表观遗传工具。其中，OMEGAoff系统通过融合DNA甲基转移酶（Dnmt3A和Dnmt3L）及转录抑制域KRAB，实现了可编程的靶向DNA甲基化和转录抑制。值得一提的是，整套OMEGAoff系统的基因组内载体编码量控制在单个AAV载体的容量范围内，为高效且低免疫风险的体内基因治疗铺平道路。
在体外细胞实验中，OMEGAoff对多个人类及小鼠基因实现了稳定的转录沉默，且伴随靶基因启动子区域CpG位点的DNA甲基化明显上升。研究显示，编辑效应可持续超过三周以上，即便编辑工具表达水平降低，表明DNA甲基化带来的表观遗传调控具备长效记忆机制。更令人振奋的是，在小鼠体内，通过AAV介导的OMEGAoff系统靶向PCSK9基因，成功实现了血清PCSK9蛋白和胆固醇水平的持久降低，且无明显毒性反应，展示了其优异的临床转化潜力。 在与其他紧凑型基因编辑工具的比较中，NovaIscB无论在基因敲除活性还是特异性方面均表现优异。尤其是在脱靶风险控制上，与传统的蛋白突变提升活性的IscB变体相比，NovaIscB依托REC域的结构优化实现了更精准的靶向识别，减少了非特异性DNA结合，提高了基因组安全性。此外，该系统依托天然生物多样性优势，具有潜在的低免疫原性，有助于未来临床应用。
虽然NovaIscB的目标相邻序列（TAM）较为限制，以NTAAA序列为主，但足以覆盖超过90%的人体编码基因和93%的启动子区域，基本满足大部分基因调控需求。未来的研究或将通过蛋白域互换及定向进化，进一步拓展其TAM兼容性，提升其对更丰富基因组靶点的可及性。 从整体来看，NovaIscB的研发标志着基因编辑工具设计思路的重大变革。结合自然进化多样性、大规模构建筛选、深度学习结构预测和理性蛋白质工程，打造了一个在分子精准调控和载体递送效率间达成理想平衡的高性能编辑平台。不仅促进了基础遗传学研究，同时为遗传相关疾病、代谢疾病及癌症等多种临床难题提供了新的治疗策略。 展望未来，NovaIscB有望进一步融合碱基编辑、反转录酶编辑等多功能域，开发更为复杂和精细的基因组及表观基因组操作工具。
通过优化载体系统和免疫规避策略，将加速其在基因治疗中的安全有效应用。随着技术的成熟，NovaIscB及其衍生编辑器在精准医学、疾病预防和治疗领域有着广泛的应用前景，推动生命科学迈向更加精准和个性化的新时代。
