铁是人体必需的重要微量元素,其通过载体蛋白转铁蛋白与转铁蛋白受体(TfR)共同实现细胞内的有效输送和调控。转铁蛋白受体作为一种二聚体膜蛋白,每个亚基由三个功能域组成:螺旋域、类蛋白酶域和顶端结构域。尽管前两个结构域在铁的结合和运输中发挥着核心作用,顶端结构域的生物学功能长期以来尚未得到充分阐明,这也制约了相关领域的研究与应用发展。近年来,借助计算骨架设计技术,科学家成功实现了顶端结构域的结构域分离和可溶性重构,这不仅提供了单独表达的稳定蛋白样本,还为研究该结构域的生物学功能及其与病原体的相互作用铺平了道路。 计算骨架设计的核心优势在于其能够通过精确地调控蛋白质主链的构象和氨基酸序列,实现结构域的空间重组和表面性质优化。在转铁蛋白受体顶端结构域的工程中,研究人员通过基于RosettaRemodel软件的重建方法,对天然结构中的长而无序的环区进行了切除和重新连接,并针对该区域的疏水残基进行了极性氨基酸替换,极大地减少了蛋白的非特异性聚集风险。
同时,设计还调整了影响蛋白水溶性的外露表面,尤其是那些与其它结构域形成结合界面的"热点"疏水残基,使得蛋白在脱离整体受体结构的情况下仍保持高度的稳定性和单分散性。 在实验表达方面,设计出的AP01方案被克隆入大肠杆菌表达系统,结果显示该蛋白不仅能够高效可溶表达,而且经过亲和层析和凝胶过滤纯化后得到的产物主要呈单体状态,分子量与预期理论值吻合。质谱分析进一步证实了表达蛋白的准确分子质量,保证其纯度与完整性。此后的X射线晶体学结构测定揭示,AP01结构域在空间构象上与天然结构高度一致,除了重新设计的无序环区表现出一定的构象调整。该环区的调整虽不同于最初的设计模型,但结构总体保守,显示了设计策略的稳健性。 此外,为了深入优化环区的构象稳定性和能源景观,研究人员通过截短并重新设计环区长度,获得了包含12个氨基酸的最佳环长度,这一长度在能量和构象空间上表现出良好的折叠漏斗特征,指示出较高的构象稳定性。
基于此,第二个设计AP02被开发并进行了表达验证,尽管其溶解性较AP01有所下降并略显易聚集,但仍为后续蛋白工程提供了宝贵的结构和功能信息。 顶端结构域不仅仅在铁的转运中具有潜在角色,更是多种外源病原体进入宿主细胞的关键识别位点。例如,马乔普病毒的糖蛋白MGP1和疟原虫的结合蛋白RBP2b都特异性结合该结构域,完成进入过程。通过对设计蛋白AP01的结构与天然受体复合物的对比,发现尽管环区构象发生了变化,但关键的接触界面大多数得以保留,只有一个盐桥相互作用因环区重构而丢失,这表明设计的蛋白仍具备与病原蛋白相互作用的潜能,具有成为治疗和诊断工具的可能。 值得注意的是,因表达于细菌系统,AP01缺失了天然受体上存在的糖基修饰,然而经实验分析,这些糖基位点多位于与病原体结合的相反面,推测对蛋白的结合活性影响有限。此外,缺失糖基的设计版本提供了更简便且高通量的生产途径,有助于加速相关结构域的药物筛选和功能研究。
该研究不仅为转铁蛋白受体顶端结构域的生物学作用提供了新的实验工具和结构基础,也为利用计算手段解决蛋白质结构域独立表达与稳定性问题开辟了范例。未来,结合定向进化和高通量筛选,这些设计蛋白有望通过引入特异性突变进一步增强与病原体或药物分子的结合能力,用于开发新型靶向递送系统或作为病原体阻断剂。 总结来看,计算骨架设计技术通过精准调控蛋白质的主链长度及氨基酸组成,实现了转铁蛋白受体顶端结构域的高效可溶性表达与结构验证,打破了传统结构域依赖整体蛋白框架限制的局限,推动了铁代谢及细胞内转运相关基础研究和应用探索的进步。该策略的成功有望激励更多复杂多结构域蛋白的独立结构域设计和功能开发,为蛋白质工程和生物医药领域注入新的活力。 。
