单细胞转录组图谱iPain揭示神经元衰老是慢性疼痛治疗的潜在靶点
慢性疼痛是全球范围内严重的健康问题,影响超过12亿成年人。尽管现有治疗方法能提供一定程度的缓解,但这些方法往往伴随副作用和成瘾风险。更深入地理解慢性疼痛的分子机制,可能为开发创新、非成瘾的治疗策略提供新的途径。近期,研究人员构建并利用了iPain单细胞转录组图谱,对脊神经节和三叉神经节在慢性疼痛发展过程中的变化进行了系统研究。这一研究揭示,一小部分疼痛感知神经元的衰老可能是慢性疼痛的驱动因素。这一机制在动物模型和人类患者中均有观察到。
尤其值得注意的是,通过靶向衰老细胞的药物(称为"清除衰老细胞药物")能够逆转小鼠在神经损伤后的疼痛症状。这些发现不仅阐明了细胞衰老在慢性疼痛发展中的作用,还为开发新型疼痛治疗方法提供了重要线索。慢性疼痛的感知主要由疼痛感知神经元(即神经元)介导,这些神经元的细胞体位于脊神经节和三叉神经节中。神经元可分为多种亚型,包括肽类神经元、非肽类神经元、C型低阈机械受体神经元和一种表达生长激素释放抑制素的神经元亚型。这些神经元在全身分布广泛,向脊髓或脑桥投射,将疼痛信号传递至上级中枢,最终被感知为疼痛。单细胞RNA测序技术的引入,极大地推动了对疾病发展复杂性的理解,类似于其他领域如癌症和神经系统疾病中构建的全面图谱。
为了构建更全面的图谱,研究人员整合了多个单细胞或单核RNA测序数据集,包括来自同行评审文献和实验室内部数据。这些数据集涵盖了不同慢性疼痛模型和发展阶段,为系统研究慢性疼痛发展过程中的分子动态提供了机会。通过使用基于变分自编码器的整合模型,研究人员能够有效地调和不同数据集,控制批次校正,同时保留生物学信息,以捕捉与疼痛慢性化相关的分子动态和多样性。iPain图谱,特别是iPainDRG,整合了来自7个来源的191,798个细胞(包括实验室生成的4468个细胞和625个细胞),为理解神经元在损伤后的分子动态及疼痛慢性化过程提供了全面资源。类似地,iPainTG整合了来自5个来源的87,838个细胞(包括实验室生成的124个细胞),为理解三叉神经节在各种疼痛状态下的响应提供了洞察。这些图谱包含详细的细胞类型特异性标记和染色质可及性配置文件,可作为研究慢性疼痛分子机制的有价值参考。
为了更好地理解神经元在慢性疼痛发展过程中的细胞状态变化,研究人员使用了iPainDRG数据集,因为它包含比iPainTG更多的疼痛模型,并覆盖了疼痛慢性化的整个过程。所有使用的疼痛模型均已知在1-3天内发展,在2-3周内达到高峰,并持续数周。因此,研究人员选择分析28天后的样本,此时疼痛已经慢性化且稳定。通过iPainDRG,研究人员进一步分离并重新聚类了来自疼痛系统的神经元,然后使用均匀流形近似和投影(UMAP)可视化损伤后的分子变化。研究人员观察到,神经元在UMAP可视化中呈现出一种模式,反映了它们的实验时间点及与无痛或损伤状态的连接。在UMAP可视化中,无痛(0天)状态的神经元位于周围,而损伤后的神经元开始向中心移动。
到28天后,这种表型逆转,大多数神经元返回到图的周围。为了进一步研究这些分子变化,研究人员将生成的莱登聚类区域分类为"无痛"(无痛)和"有痛"(有痛)宏状态,基于它们与"参考"状态(无损伤和假手术条件)或非参考状态的对齐。差异表达分析确认"有痛"类别与轴突再生和轴突引导相关基因上调有关,这与之前的报道一致。值得注意的是,"有痛"和"无痛"宏状态可以进一步细分为微状态,以精细化时间上的细胞进展。这些微状态结合伤害时间点,被命名为参考、移动、疼痛、恢复和持续疼痛。参考状态(时间点0)代表未受损伤的细胞,自然属于"无痛"。
疼痛状态代表排除28天时间点的"有痛"中的神经元。28天后损伤的"有痛"中的细胞被标记为持续疼痛状态。剩余的损伤后时间点但表现为"无痛"的细胞进一步区分:疼痛发展的早期阶段(不超过1.5天)为移动,晚期阶段(1.5-28天)为恢复。这种分类基于观察到所有细胞在1.5天时间点均处于"有痛"宏状态,而"无痛"状态的细胞在1.5天前后均有观察到。因此,1.5天前的"无痛"状态细胞被认为正在向疼痛移动,而1.5天后的"无痛"状态细胞被认为正在从疼痛中恢复。通过RNA速度分析和PAGA图分析,研究人员进一步验证了这些微状态。
此外,研究人员使用RNA速度转换矩阵进行广义佩龙簇簇分析(GPCCA),观察到细胞状态与定义的状态高度一致。这些分析表明,iPain图谱中的神经元在慢性疼痛模型中动态进展。研究人员进一步提取了神经元中负责微状态转变的驱动基因,并进行了细胞间通信分析,以理解细胞变化的起源,重点关注神经元、免疫细胞和卫星胶质细胞之间的通信。在神经元中,分析基于终末状态的驱动基因显示,许多基因属于"再生相关基因"(RAGs),其活动随细胞追踪伪时间动态变化。Sox11被确定为所有神经元亚型中排名前五的驱动基因中的唯一转录因子。研究人员使用SCENIC识别了与控制神经元动态细胞状态转变的分子程序相关的调控子,并结合了损伤后ATAC峰的可及性分析。
识别出的调控子包括Atf3、Jun和Sox11。特别是,Sox11调控子的活性随着伪时间增加而增加,并在持续疼痛状态下保持高水平,与Atf3和Jun调控子不同,后者在初始增加后活性下降。这表明SOX11可能是神经病理性疼痛发展和维持的潜在驱动基因,这一假设最近通过体内实验得到了确认,进一步支持了分析的可靠性。为了理解细胞间通信模式,研究人员结合了所有细胞类型,包括非神经元细胞,并使用张量分解方法。这种方法提取了多细胞基因表达模式,这些模式在不同细胞类型、疼痛模型(上下文)和时间点中变化,以无偏地识别参与细胞间相互作用的分子配体-受体对群。在分析中,这些群,也称为"因子",捕捉了神经元分子变化与免疫细胞和卫星胶质细胞在参考和非参考(移动、疼痛、恢复和持续疼痛)状态下的相互作用。
识别出了六个因子,其中因子3在参考和非参考条件之间变化最大,同时影响了iPainDRG中包含的所有疼痛模型。因此,研究人员对因子3中特征化的配体-受体对进行了基因富集分析,以理解其生物学意义。p53通路是因子3最丰富的通路,表明在疼痛进展过程中p53通路上调。值得注意的是,p53、p21和p16肿瘤抑制基因在"因子"中的分布与损伤条件下的表达相关,强烈表明在疼痛慢性化过程中存在细胞衰老。细胞衰老最初在分裂细胞中被发现,后来扩展到包括非分裂细胞在内的各种组织。细胞衰老涉及细胞在应激下改变其特征表型,导致一种称为衰老相关分泌表型(SASP)的独特表型,表现为释放炎症细胞因子、生长因子和蛋白酶。
SASP通过多种机制发挥作用,通常涉及自体或旁分泌信号。为了简化和标准化衰老分析,梅奥诊所最近引入了SenMayo基因集,包含广泛的SASP相关基因。使用这种方法,研究人员通过选择SenMayo z分数前10百分位的细胞来识别SASP阳性细胞,并将其突出显示在散点图中,显示GenAge分数(与模式生物衰老相关的基因集)与CellAge分数(与人类细胞衰老相关的基因集)的关系。这种分析表明,受损伤影响的细胞在GenAge和CellAge方面比无损伤细胞更先进。在评估CytoTrace分数后,研究人员发现伤害后的一小部分神经元的细胞可塑性潜力降低,从而提出了假设:慢性伤害模型中疼痛持续的原因可能是由于无法将表型逆转为参考状态的损伤诱导的衰老细胞持续存在。为了验证这一假设,研究人员首先通过计算基于SenMayo基因集的基因模块分数来识别疼痛系统中的衰老细胞。
在评估分数后,研究人员发现SenMayo z分数在每种神经病性疼痛模型中与对照组相比都有所增加。统计测试显示,SenMayo z分数在伤害后的神经元中高度富集,在所有疼痛模型中(除了Paclitaxel),在动态状态中,以及在所有神经元亚型中,无论生物性别如何。此外,SenMayo z分数在恢复状态中与疼痛和持续疼痛状态相比显著较低。有趣的是,疼痛状态与参考状态相比,所有疼痛系统亚型的SenMayo z分数均有所增加。然后,研究人员验证了衰老发展的时间进程,通过检测伤害后DRG的Senescence-Associated Beta-galactosidase(SA-β-Gal)染色。在小鼠模型中,研究人员识别出一小部分神经元表现出衰老表型,这些神经元表达神经核标记(NeuN)并具有较小的尺寸。
此外,伤害伴随从第7天开始的p21的核表达增加。这些体内发现支持使用SenMayo z分数作为衰老的可靠标志物的可靠性。对于TG,图谱覆盖的时间点有限,无法进行适当分析。因此,研究人员评估了三叉神经根入区(TREZ)压迫模型中TG组织的SenMayo z分数,该模型模拟了与三叉神经压迫相关的剧烈疼痛疾病,如三叉神经痛(TN,也称为自杀病)和群发性头痛(CH,一种三叉自主性头痛)。为此,研究人员使用了Tao等人提供的大鼠TN模型的RNA-seq数据集,计算分数。研究人员发现SenMayo z分数与对照条件相比明显增加,表明DRG和TG均使用衰老作为疼痛慢性化机制。
然后,研究人员评估了人类样本中的SenMayo z分数,重点关注DRG(目前没有可用的TG数据集或疼痛患者的样本)。SenMayo z分数在患有慢性疼痛的人类DRG中升高,与生物年龄无关。通过使用人类参考图谱对原始数据进行去混合,研究人员发现疼痛系统在慢性疼痛条件下的SenMayo z分数显著升高,进一步强调了疼痛系统衰老在人类慢性疼痛中的作用。类似的结果在从糖尿病神经病变患者中提取的DRG bulk-seq中观察到。这些人类结果支持我们发现的转化价值。重要的是,在小鼠中,衰老分数在所有疼痛模型中均显著升高,与生物性别无关。
虽然疼痛系统的衰老在不依赖于衰老的慢性疼痛背景下是意想不到的,但靶向衰老细胞的药物(称为"清除衰老细胞药物")已在临床前和临床试验中得到很好的表征。清除衰老细胞药物利用了衰老细胞抗凋亡途径(SCAPs)。干扰这些途径中蛋白质的表达可以选择性地消除衰老细胞,同时保留相邻细胞和组织生理。本研究中使用的清除衰老细胞药物包括B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白家族的生物可用性小分子抑制剂,如Navitoclax(ABT-263)、Venetoclax和蛋白酶降解靶向嵌合体(PROTAC)Bcl-XL降解剂,后者旨在控制该类分子对血小板计数的相关副作用。为了测试靶向衰老细胞是否能够缓解慢性疼痛模型中的疼痛敏感性,研究人员将这些各种清除衰老细胞药物或载体给予小鼠,这些小鼠经历了慢性约束损伤(CCI)并在第7天发展出高敏感性和疼痛。令人惊讶的是,接受清除衰老细胞药物治疗的小鼠在神经损伤后4周内表现出显著减少或无机械疼痛迹象,与基线或相同时间点的载体相比。
然而,这些药物在实验期间或所给剂量下对热觉并未显著影响。疼痛行为的恢复与至少50%的SA-β-galactosidase阳性细胞被选择性清除相关,平均在所有药物中,在直径小的、周边素阳性神经元中。最终,被清除的细胞代表周边素阳性神经元的一个小部分。此外,体重在实验期间保持不变,血细胞计数在药物治疗组和对照组之间相似,表明清除衰老细胞药物没有明显的系统性副作用,也没有显著影响血小板计数。重要的是,作为对照,以评估清除衰老细胞药物对疼痛感知神经元的特异性作用,并控制离靶效应,研究人员测试了小鼠的焦虑、平衡和运动技能。没有观察到药物治疗组与对照条件之间的显著差异。
这些结果提供了对清除衰老细胞药物影响的更全面理解,突出了它们对机械高敏感性的选择性影响,而不影响其他感觉模式或一般健康参数。这些数据表明,在各种慢性疼痛模型中,疼痛感知神经元的亚群发生衰老,并参与疼痛状态的持续。靶向这些衰老细胞的治疗具有显著的治疗潜力。慢性疼痛的广泛流行与开发新型医疗治疗方法的紧迫需求相一致。目前治疗方法的主要局限性在于对慢性疼痛发展过程中神经元表型变化的整体理解不足。本研究通过构建和利用iPain单细胞图谱,系统研究了慢性疼痛发展过程中的细胞状态变化。
研究的一个重要发现是,在外周神经损伤后,疼痛感知神经元的一个小亚群的转录组中一致诱导了衰老表型,这一机制在动物模型和人类数据集中均有观察到。药物靶向衰老细胞进一步证明在小鼠慢性疼痛模型中有效,表明衰老细胞在慢性疼痛发展中的作用,并为人类患者提供了治疗潜力。这些数据为慢性疼痛发展提供了功能性证据,表明衰老细胞在慢性疼痛发展和持续中发挥作用,且与性别无关。本研究揭示了外周神经损伤后神经元基因表达模式的动态"内在"转变。所有亚型的共同转录组特征是Sox11。SOX11是一种参与神经系统发育和成年神经发生的转录因子,其中诱导神经特征的表达。
这表明在再生过程中发挥作用。然而,虽然已知再生相关基因如Atf3和Jun在损伤后早期时间点表达增加,但在后期时间点表达减少。相比之下,Sox11在后期时间点保持升高,表明其在持续疼痛发展和维持中的作用与再生不同。有趣的是,与慢性疼痛相关,SOX11的作用在神经病理性疼痛模型中已经预测,并且在多部位慢性疼痛(MCP)的性别分层基因组关联研究中,SOX11与女性MCP相关。此外,现在通过增益和丢失功能报告,SOX11在神经病理性疼痛的启动和维持中起着重要作用。这些发现进一步支持了iPain的资源性。
此外,我们的方法和工作流程与跨物种图谱不同,后者也整合了来自多个来源的数据,但侧重于研究不同物种之间的分子保守性。相比之下,iPain专门用于以针对性方式绘制慢性疼痛发展的轨迹。之前的研究将细胞衰老与慢性疼痛联系起来,特别是在脊髓中,可能是几个月后损伤后发生的次生过程,并且在某些情况下表现出男性特异性效应。然而,使用清除衰老细胞药物局部治疗脊髓并未提供对神经病理性疼痛的持续缓解,表明这种方法并未解决所研究模型中神经病理性疼痛的主要机制。然而,我们的研究发现,细胞衰老与慢性疼痛的联系始于急性期之后,与神经病理性疼痛/慢性疼痛的发生相关。我们观察到在各种外周神经损伤和炎症模型中,疼痛感知神经元发生衰老,以及在TREZ压迫模型中,TG发生衰老。
此外,我们发现这种效应与性别无关;无论是雄性还是雌性动物,疼痛感知神经元中的细胞衰老水平相似。这表明与之前报告的机制不同。最后,虽然我们的研究侧重于年轻和中年成年动物,但这种机制也可能在老年人中发挥作用,或者在神经损伤或对照条件下更容易诱导疼痛感知神经元的衰老表型。综上所述,我们的单细胞转录组图谱为通过定义与外周神经损伤相关的疼痛疾病相关的细胞和通路,可能为药物发现努力提供重大进展。我们的发现表明,与当前有限的慢性疼痛治疗选项不同,存在替代治疗方法。这一假设在小鼠中得到了验证,并通过对慢性疼痛患者和糖尿病疼痛性神经病变患者的体外分析,表明对人类有转化潜力。
选择性清除少数功能障碍的、衰老的神经元,可能是为了实现患者长期福祉的值得交易,特别是在治疗选择有限的剧烈疼痛疾病中,如TN和CH,这些疾病与三叉神经压迫相关。当前,几种清除衰老细胞药物,包括本研究中使用的药物,正在进行临床开发,用于抗衰老和癌症相关疾病。这支持了通过靶向衰老来治疗人类持续疼痛的策略。因此,清除衰老细胞药物代表了管理慢性疼痛的有前景的方法。 。
