Western Blot技术作为分子生物学领域中检测特定蛋白表达水平的重要方法,广泛应用于基础研究和临床检测中。在进行Western Blot实验时,内参蛋白(housekeeping proteins)的选择至关重要,它不仅影响数据的可靠性,也关系到后续定量分析的准确性。内参蛋白通常被视为在不同实验条件和处理下表达稳定且丰度适中的蛋白,可用于校正因样品装载量和转膜效率差异所引起的误差。然而,现实中选择合适的内参蛋白并非易事,尤其是在检测高分子量目标蛋白或特定细胞取向的实验中,经典的内参蛋白如β-肌动蛋白(Beta-actin)、GAPDH和α/β-微管蛋白等常常因分子量不匹配或表达波动而无法满足需求。传统的内参蛋白分子量一般集中在40-60 kDa之间,如GAPDH约36 kDa,β-肌动蛋白约42 kDa,微管蛋白约50-55 kDa,对于分子量较大的蛋白分析时可能重叠且难以分辨,特别是在采用低百分比聚丙烯酰胺凝胶、需要分离大蛋白时,内参蛋白无法正常显示或信号弱化,从而导致定量数据失准。针对这一问题,研究者提出采用高分子量的内参蛋白替代方案。
例如,热休克蛋白70(Hsp70)分子量约70 kDa,α-肌动蛋白(α-actinin)约100 kDa等,均作为较好选择,避免尺寸干扰的同时,也具有较为稳定的表达水平。同时,选择内参蛋白时不仅要参考分子量,还需考虑其在实验模型和处理条件下的表达稳定性。某些处理因素如药物、应激、细胞周期变化等均可能影响经典housekeeping蛋白的表达,甚至引起显著波动。以肌动蛋白为例,尽管普遍用作内参,但多项研究表明其表达会受到细胞骨架重建、细胞迁移和凋亡等过程影响。此外,细胞类型差异、组织来源和疾病状态等因素同样影响housekeeping蛋白的表达稳定性。因此,单一选择传统内参蛋白往往不足以保证准确性,自我验证内参蛋白的表达稳定性应成为实验设计的重要环节。
现代实验建议结合多个潜在内参蛋白同时检测,基于统计软件与算法分析选择稳定表达蛋白作为最终正常化标准,以提升Western Blot定量分析的可信度。技术优化方面,针对高分子量蛋白分离的需求,低百分比聚丙烯酰胺凝胶(如6%)可提供更优分辨率,有助于清晰区分靶蛋白和内参蛋白。然而,低浓度凝胶也会影响分辨率范围和迁移速度,可能导致低分子量蛋白跑得过快而丢失。因此,实验者必须在内参蛋白分子量和目标蛋白大小之间权衡选择。除了凝胶浓度调整,优化电泳条件、延长运行时间和优化转膜条件也是提升Western Blot质量的关键。转膜过程中,针对大分子量蛋白需延长时间,采用湿转法更利于蛋白完整转移,从而保证内参蛋白和目标蛋白信号的线性和均一。
除了传统内参蛋白校准方法,近年来的研究也提出采用全蛋白染色法(如Ponceau S、SYPRO Ruby等)作为加载控制的替代策略。全蛋白染色基于样品中所有蛋白总量的均一性,减少了单一蛋白表达变化带来的偏差。不过此策略需结合高质量成像设备和图像分析软件辅助定量,且对样品处理和转膜条件要求较高。综上所述,Western Blot中housekeeping蛋白的选择不仅仅是固定某一种经典内参,而需根据实验具体情况灵活调整。了解内参蛋白的分子量分布、表达稳定性及可能受实验处理影响的情况,能够使研究人员更科学地设计实验流程。高分子量housekeeping蛋白如Hsp70和α-肌动蛋白为目标蛋白分子量较大的Western Blot实验提供有力支持。
同时,采用多种内参蛋白联合验证,结合全蛋白染色法,可更好地保证数据的准确性和重复性。未来,随着定量蛋白质组学和高通量技术的发展,更多稳定可靠的housekeeping蛋白将被发现和应用,为不同研究领域提供适宜的加载控制方案,推动蛋白表达研究的深入开展。 。
